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iNature： 2018年2月20日及22日，Cell Research杂志在线接连发表了来自美国马里兰大学医学院刘阳/郑盼教授联合实验室在CTLA-4肿瘤免疫治疗领域的最新研究成果。题目分别为 “A reappraisal of CTLA-4 checkpoint blockade in cancer immunotherapy”及“Uncoupling therapeutic from immunotherapy-relatedadverse effects for safer and effective anti-CTLA-4 antibodies in CTLA4humanized mice”。刘阳/郑盼教授联合实验室构建的CTLA-4分子人源化小鼠可用于研发副作用低且高效抗肿瘤的针对CTLA-4分子的人源化抗体。

 近年来，癌症免疫治疗的临床应用取得了显著进展，已经成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后癌症的另一有效治疗手段。在各种免疫治疗方式中，免疫检查点疗法是近几年获得突出疗效的治疗方法。

免疫检查点抑制剂是一类通过抑制T细胞或肿瘤特异性细胞上受体分子而影响T细胞功能的免疫调节药物，主要包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）的抗体（如伊匹单抗Ipilimumab）及抗程序性细胞死亡1（PD-1）及配体的抗体（如帕姆单抗、纳武单抗）。该类药物已经在多种类型肿瘤中表现出了令人振奋的临床抗肿瘤效果，但实际应用中会出现一些免疫相关不良反应，有时极为严重、甚至致命。如何提高CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的效果并减少其诱发的免疫副作用，一直是癌症免疫治疗中的一个新难题。

CTLA-4分子高表达于调节性T淋巴细胞（Treg）和激活的T淋巴细胞上,与CD28一样，均为免疫球蛋白超家族成员，与相同的配体CD86和CD80结合，具有高度同源性。但是，CTLA-4具有更高的亲和力，可以竞争性地与CD86结合。2011年，美国FDA批准首款CTLA-4抗体抑制剂Ipilimumab（商品名YERVOY®）用于黑色素瘤的治疗。免疫检查点阻断的假说（Checkpoint BlockadeHypothesis）认为CTLA-4抗体通过在外周淋巴器官中阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路来促进T细胞的激活而发挥抗肿瘤作用。然而这一流行假说并没有得到严格的实验验证。

刘阳/郑盼教授联合实验室的一系列的体外及体内研究表明，在生理相关条件下Ipilimumab并不能很好地阻断CTLA-4/B7的相互作用。尽管如此，它的抗癌效果与在各种条件下都能阻断CTLA-4/B7相互作用的另一抗体L3D10没有明显差别。有意思的是L3D10进行完全人源化后筛选得到的两株失去阻断CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗体并没有影响抗肿瘤效果，甚至强于Ipilimumab。多方面的实验表明CTLA-4抗体的抗肿瘤效果并不依赖于抑制性信号通路CTLA-4/B7的阻断。同时，他们的数据还表明，在淋巴组织中不能促进免疫反应的条件下，Ipilimumab 仍然有明显的抗癌效果，说明CTLA4免疫检点假说的两个根本推论都需要重新评价。

所有能有效抗肿瘤的CTLA-4抗体，包括阻断能力非常强的L3D10和阻断能力比较弱的Ipilimumab/HL12/HL32都能够有效的清除肿瘤局部的Treg。用Fc受体的阻断性抗体2.4G2同时处理小鼠来消除抗体介导的细胞杀伤作用（ADCC）或抗体介导的细胞吞噬作用（ADCP），则能显著逆转Ipilimumab的抗肿瘤效果。因此，刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明，抗CTLA-4抗体发挥治疗肿瘤功效的主要机制是通过清除肿瘤局部的Treg，而不是通过阻断CTLA-4/B7的抑制性信号通路。这项研究对当前流行的在癌症免疫治疗中针对CTLA-4分子的免疫检查点的理论假说提出了挑战。

刘阳/郑盼教授联合实验室在CTLA-4领域的另一个方面的研究，集中在免疫治疗诱导的副作用（irAE，immunotherapy related adverseevents）。Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗“免疫检测点抑制剂”的第一个药物，具有比较好的抗黑色素瘤的作用，但同时也有非常强的免疫治疗诱导的副作用（N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.），特别是和Nivolumab （抗PD-1的抗体）等抗体强强联合后一半以上的患者产生了3-4级严重的副作用，因此限制了抗CTLA-4抗体的研发与应用（Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.）。目前，并没有一个非常理想的临床前模型来评估CTLA-4抗体免疫治疗诱导的副作用。

刘阳/郑盼教授联合实验室在CTLA-4人源化的新生小鼠模型中发现Ipilimumab可以导致严重的副作用，特别是联合PD1抗体后副作用加重。这些副作用的表型和临床发现的Ipilimumab单独治疗或联合PD1抗体治疗后产生的副作用表型非常相似。比如，贫血，心脏炎症，肺炎，肝炎，肾脏等多器官炎症。值得注意的是2016年两篇NEJM文章报道了接受Ipilimumab治疗的个别患者出现了贫血或心脏毒性导致的死亡（N Engl J Med. 2016 Mar 17;374(11):1096-7.doi: 10.1056/NEJMc1509362.和N Engl J Med. 2016 Nov 3;375(18):1749-1755.），并不在常规的Ipilimumab副作用的统计中，而在这个小鼠模型中却都有非常强的表型。另外惊奇的发现L3D10并没有产生严重的副作用。

图1. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型来模拟临床上Ipilimumab单用及联用造成的免疫相关副作用，并评估Ipilimumab和其它CTLA-4抗体的安全性。A.药物处理后雄性小鼠体重增加百分比;B.小鼠下肢骨及骨髓悬液图片;C.小鼠心脏图片;D各个脏器病理切片毒性评估。

有意思的是在杂合子小鼠（CTLA4h/m，一半表达人的CTLA4分子，一半表达鼠的CTLA-4分子）中，Ipilimumab的副作用表型并不明显。他们发现这种副作用和全身的T细胞激活相关，和自我反应性T细胞中抑制性T细胞（Treg）和效应T细胞的比例相关，而且这种副作用需要双等位基因的参与，而抗肿瘤作用并不需要双等位基因的参与。当他们完全人源化L3D10抗体后，得到的HL12/HL32抗体虽然丧失了阻断CTLA-4/B7相互作用的能力，但保留了良好的抗肿瘤效果且副作用更低了。

图2. 天然T细胞的减少和效应T细胞的增加与多器官免疫毒性成正相关。

刘阳/郑盼教授认为CTLA-4抗体的副作用和完全的CTLA-4分子的占有，全身T细胞激活，选择性扩增自我反应性T细胞相关，阻断CTLA-4/B7抑制性信号通路和抗肿瘤效果和副作用的产生都没有相关性。CTLA-4抗体的抗肿瘤效果和副作用的产生并不是相伴相随的，机制是不一样的，应用CTLA-4分子人源化的小鼠模型完全可以开发出副作用小抗肿瘤效果好的CTLA-4抗体。

刘阳/郑盼教授联合实验室的一系列突破性研究成果，进一步阐明了抗CTLA-4抗体的抗肿瘤机制，提供了有效评价针对CTLA-4分子的人源化抗体药物安全性的小鼠模型，并初步筛选得到相对于Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗体HL12和HL32，这些研究对今后抗CTLA-4抗体以及以CTLA-4为靶点的其它类型药物的研发有着重要的指导意义。

本研究完成于作者先前所在的美国国家儿童医学中心的癌症与免疫研究中心。论文的共同第一作者杜雪相博士，唐飞博士和刘明月博士在刘阳教授和郑盼教授的共同指导下完成了此研究项目的主要内容，同时也离不开CTLA-4课题组成员苏娟娟，张燕，吴炜，叶佩莹等研究人员实验上大力的帮助及张鹏专业的统计分析。美国OncoImmune, Inc公司、美国Immutics, Inc公司以及中国苏州康宁杰瑞Alphamab, Inc公司贡献了本研究中用到的抗体等实验试剂和Biacore/surfaceplasmon resonance等技术支持。本研究得到美国国立卫生研究院的基金（NIH grants AI64350, CA171972 and AG036690）以及来自OncoImmune, Inc公司的基金资助。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-018-0011-0

https://www.nature.com/articles/s41422-018-0012-z

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