Nature Biotechnology|CRISPR基因编辑技术新突破
iNature：用Cas9-sgRNA体内进行有效的基因组编辑需要使用病毒运输系统，这在临床应用上有很大的局限性。开发其他RNA治疗药物的转化努力表明，通过降低对核酸酶降解的易感性，对RNA进行审慎的化学修饰可以改善治疗效果。在Cas9-sgRNA复合物的结构的指导下，Anderson等人确定了可以修饰的sgRNA区域，同时保持或增强了基因组编辑活性，并为体内应用开发了一套最佳的化学修饰。使用这些增强的sgRNAs（e-sgRNA）和编码Cas9的mRNA的脂质纳米颗粒制剂，显示向小鼠单次静脉内注射，诱导肝脏中Pcsk9> 80％编辑效率。血清Pcsk9降低到检测不到的水平，并且动物中胆固醇水平显着降低约35％到40％。这种策略使用非病毒策略，基于Cas9的基因组编辑在临床环境具有巨大的潜力。
基于CRISPR在基因组编辑中，对于广泛的疾病中具有相当的治疗潜力【1-5】。一个关键的挑战是实现基因组编辑大分子的高效，临床适合的运输及传递过程。 RNA引导的核酸酶（Cas9）和单个引导RNA（sgRNA）【2】的复合物CRISPR-Cas9，通过Watson-Crick碱基配对【2】，识别基因组中的核苷酸的序列【3-5】，并产生双链DNA断裂（DSBs）过程，通过内源性细胞机制如同源性定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）修复【5】。
CRISPR在不同物种的应用
已经使用病毒载体（包括腺相关病毒（AAV）【6-9】）显示体内Cas9-sgRNA的长期表达。然而，一个理想的CRISPR-Cas9传输系统将限制暴露于编辑机器的时间，以尽量减少潜在的脱靶效应【10】。另外，Cas9最常用的形式spCas9难以适应具有强启动子的典型AAV构建体【6】。虽然较小形式的Cas9被包装成单个AAV结构【11】，但当Cas9稳定表达AAV时，对潜在脱靶效应的担忧依然存在【12】。
AAV运输系统
此外，对AAV衣壳的免疫应答会限制患者的重复给药【13, 14】，并且长期存在于人体组织中的细菌蛋白Cas9也会增加免疫原性的风险【13,15】。这些限制可以使用非病毒传递系统来解决【12】。 Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）的使用已经在细胞培养和小鼠内耳细胞中的局部递送中进行了测试【16】，但是还没有被证明用于全身性体内递送过程。此前，Anderson等人使用脂质纳米粒子（LNP）封装的Cas9 mRNA与携带sgRNA和修复模板的AAV组合，在小鼠肝脏中进行有效的基因组编辑【12】。然而，一个完全非病毒，系统的Cas9基因组编辑系统，允许有效的体内基因修饰尚未被描述【17】。
纳米脂质体的组成
对于RNA治疗的相关研究，特别是短干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO），已经导致了对RNA的许多化学修饰的鉴定，其在体内递送后显著提高了基因敲除的功效【18,19】。在给药后，RNA对血液和细胞中的核酸酶特别敏感【20】。
PCSK9可能的作用机制
糖修饰的两个例子是2'O-甲基核糖核苷酸（2'OMe RNA）和2'-脱氧-2'-氟 - 核糖核苷酸（2'F RNA）形式，这样可以减少对核酸酶的易感性【18】。另外，通过包含硫酯基团，磷酸骨架的化学修饰大大增加了核酸酶抗性，从而改善了在体内能够顺利发挥其功能【18】。然而，化学修饰也会干扰治疗性RNAs的生物学功能【21】。例如，某些化学修饰可以通过阻止RNA诱导的沉默复合物（RISC）与siRNA稳定相互作用而干扰siRNA-Argonaut复合物的活性。类似地，通过使用RNA酶H发挥功能的ASO对化学修饰表现出不同的敏感性【19】。
总体流程
CRISPR/Cas9系统是由sgRNA引导，其结合了CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）【2】。这些sgRNA长约100个核苷酸（nt），在5'末端20nt与互补DNA序列杂交，剩余的结构用于Cas9识别和结合【2-5】。已经显示在5'和3'末端的三个核苷酸的化学修饰提高了人体细胞中体外基因组编辑效率【22】。 crRNA的合理化学修饰与未修饰的tracrRNA介导的人类细胞中，可以有效的进行基因组编辑【23】。然而，在这些研究中，大部分RNA仍然未被修饰，并且没有探索在体内使用这些化学修饰的可能性【22,23】。故Anderson等人推断sgRNA的体内应用将受益于重点的化学修饰。
脱靶效率的检测
在Cas9-sgRNA复合物的结构的指导下，Anderson等人开发了增强型sgRNA（e-sgRNA），定义为用2'羟基（OH）基团修饰的101nt sgRNA中的70个以及多个硫代磷酸酯键。并且确定sgRNA的区域容忍化学修饰而不抑制Cas9和sgRNA的相互作用，同时保持或增强基因组编辑活性。使用这些修改，Anderson等人证明单剂量的配制的e-sgRNA和Cas9 mRNA允许在体内肝细胞中几乎完全对于靶基因进行编辑。
原文下载：
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原文链接：
https://www.nature.com/articles/nbt.4005
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